蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）以蛋白质为研究对象，先借助SDS-PAGE凝胶，将总蛋白按照不同的分子量大小进行分离，然后将胶上的蛋白质转移到膜上，再利用相应的特异性抗体对靶蛋白进行定量或定性检测的方法。从Stark团队建立了蛋白印记的方法至今，始终如一的实验技术流程，造就了Western blot的经典所在。每一步必不可缺，每一步都需认真对待，才能最终得到一个完美的结果。样本制备时许多方位考虑，包括裂解液的选择，后续实验的应用等：1、尽可能提取完全或降低样本复杂度，集中提取某个样本部位总蛋白，比如只提膜蛋白；2、保持蛋白处于溶解状态（有针对性的对裂解液的pH盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；3、提取蛋白过程防止降解、沉淀等（最好冰上操作，并加入适量的蛋白酶抑制剂20124ES或磷酸酶抑制剂20109ES）；4、减少样本的粘稠度，去除核酸等分子（全能核酸酶20156ES或采取超声处理）；5、细菌、真菌、植物细胞或者组织，还需要借助破壁的酶来进行蛋白提取。准确测定蛋白样本浓度，既能标准化电泳时蛋白上样量，又能更好的配合内参靶标对目的蛋白进行定量分析。
选择合适的蛋白胶，能够更好的对目的蛋白进行分离及检测。原则：高浓度的蛋白胶适合分离小分子量的蛋白；低浓度的蛋白胶适合分离高分子量蛋白；梯度浓度胶可以兼容多种浓度的分离效果。
蛋白胶类型选择，既可节省蛋白电泳时间，又可对电泳效率进行提高。
转膜即将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）。蛋白转膜方法可大致分为湿转和半干转两种类型。用于Western blot的膜也有不同的类型及差异：由于SDS能够阻止蛋白与膜的结合，因此小分子蛋白转膜可不加SDS，同时甲醇浓度提高到20%；大蛋白易在凝胶里形成沉淀，转膜缓冲液中加入0.1%SDS，可增加蛋白的溶解性；由于甲醇易使SDS从蛋白上脱离，可降低甲醇的浓度（低至10%或者更低）来防止蛋白沉淀。
封闭剂种类：脱脂奶粉（36120ES）、BSA（36101ES）、动物血清等，某些品牌特定的封闭剂等。2、某些抗体使用BSA封闭可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，具体需阅读说明书 ；生物素化标记的抗体；磷酸化抗体检测蛋白磷酸化；碱性磷酸酶（AP）显色方法4、封闭时间：一般封闭1-2 h即可；后续可根据实验结果的背景强度来延长时间或更改封闭液种类。抗体根据标记靶标方式的不同，分为直标和间标法两种，具体差异如下图：常用的WB显色方法有两种，一种是DAB显色法（36201ES-36203ES）；另一种是ECL显色法（36208ES）。DAB即二胺基联苯胺，是过氧化物酶(如HRP)的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色的变化和积累，形成浅棕色不溶物。ECL( Enhanced Chemiluminescence)原理是鲁米诺被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强，具有稳定性好，灵敏度高、背景低等特点。全膜再生液可有效去除PVDF或者NC膜上结合的一、二抗，同时温和作用维持蛋白的完整性不受影响。再次在同一张膜上进行孵育另一靶标的一、二抗，实现表达量检测以及最大可能的降低重新上样引起的误差。
原则：优先检测表达量较低的目的蛋白，用再生液处理后检测表达量高的蛋白。
对于处理过或者是不同组织蛋白表达量的会涉及到量的变化，如何对这个表达量进行分析呢？此时借助不同软件，通过对Western blot的结果条带的灰度值计算，来做统计分析。比如比较简单的软件Image J可实现该功能：图9. Image J软件使用截图（图片来源网络）Image J软件，根据靶标蛋白以及内参蛋白的条带灰度，实现靶标蛋白的表达量分析。灰度的概念是使用黑色调表示物体，即用黑色为基准色，不同的饱和度的黑色来显示图像。采用ECL发光时，蛋白条带发出的荧光会曝光在胶片上，留下的黑色条带。定量分析：以标准品为对照，定量确定组织或细胞中目的蛋白的表达情况；实验研究：不同蛋白之间的相互关系、蛋白与核酸之间的相互关系；应用互补：常配合ELISA来进一步分析蛋白功能（图10左）、免疫荧光IF对靶蛋白定位分析（图10右），以及配合流式FACs和组化IHC等技术共同研究。图10. ELISA及免疫荧光IF实验结果图（图片来源于网络）
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